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学科主题: 物理化学
题名: 重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的表达、提取及固定化研究
作者: 孙健
答辩日期: 2008-05-09
导师: 许国旺/袁中一
专业: 分析化学
授予单位: 中国科学院研究生院
学位: 博士
摘要: 抗生素的滥用导致微生物产生耐药性,开发新的抗生素是应对的有效措施,半合成β-内酰胺类抗生素成为其中的热点。青霉素G酰化酶是半合成β-内酰胺类抗生素工业中重要的生物催化剂,尽管已对其研究多年,但大规模工业生产所必需的优良酶类仍然缺乏,运用基因工程获得优良的酶源、优化表达条件提高酶产量以及对酶进行固定化改善其催化性能是解决的途径。 粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(Alcaligenes faecalis penicillin G acylase, AfPGA)具有其他来源的PGA所没有的优良特性。本文在前人构建表达菌株的基础上对摇瓶培养条件进行了考察,并在此基础上初步进行了发酵罐中培养实验,在培养条件30℃、pH 7.0、溶氧30%时,流加50 g/L糊精,培养时间180小时,菌体密度最高达到34,酶活最高达到9500 U/L。 比较了七种破碎大肠杆菌细胞获得AfPGA的方法,结果表明玻珠震碎法、超声波法和渗透压法是较优的细胞破碎方法,活力回收率均为60%以上,有机溶剂法、冻融法、玻珠研磨法及盐酸胍/EDTA法均低于22%。粗酶液经离子交换、疏水层析两步纯化,纯度提高20倍,总回收率为91%。 筛选出两种新载体ZH-EP和ZH-HA对AfPGA进行了固定化,工业常用载体Eupergit C作为对照。三种固定化酶的性质没有明显差异,而ZH-EP和ZH-HA有着比Eupergit C更快的固定化速度、更高的饱和结合蛋白量从而更高的固定化酶活力,表明了ZH-EP和ZH-HA的工业应用潜力。 建立了AfPGA分子结构模型并通过Procheck程序进行评估,分析出C末端或N末端均在酶分子的外侧,而且远离催化中心位点,在其末端引入his标记以进行定向固定化是可行的。通过PCR反应在AfPGA分子末端引入his标记,得到了带有his-tag标记的AfPGA作为后续定向固定化研究的酶源。
语种: 中文
内容类型: 学位论文
URI标识: http://cas-ir.dicp.ac.cn/handle/321008/114893
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孙健. 重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的表达、提取及固定化研究[D]. 中国科学院研究生院. 2008.
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