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学科主题物理化学
蛋白质组酶解的新技术和新方法研究
吴帅宾
2012-01-17
导师张玉奎 ; 张丽华
专业分析化学
授予单位中国科学院研究生院
学位博士
英文摘要在基于鸟枪法的蛋白质组学研究中,蛋白质酶解是必不可少的步骤。本论文为提高蛋白质样品的酶解速度,以及消除对质谱鉴定的干扰,发展了蛋白质组酶解的新技术和新方法,具有重要的科学意义和实用价值。 以有机-无机杂化硅胶材料作为基质,通过一步的环氧-戊二醛反应实现了胰蛋白酶的 固定化,制备了一种基于有机-无机杂化硅胶整体材料的固定化酶反应器(IMER)。可将牛 血清白蛋白(BSA)的酶解时间从16h 缩短到50s,取得与自由溶液酶解相当的序列覆盖率。 将其应用于鼠肝提取蛋白质分析,经80s 酶解,可从2μg 大肠杆菌提取蛋白中鉴定出84 种蛋白质。 通过热聚合的方式,制备了一种基于聚(丙烯酰胺-CO-双甲基丙烯酰胺)亲水性整体材 料的IMER。不仅具有良好渗透性、机械强度和亲水性,而且能够在20s 内完成BSA 的酶 解,序列覆盖率达到57%,优于传统的12h 自由溶液酶解。酶解蛋白质的最小浓度可达到 fmol。将其应用于大肠杆菌提取蛋白质分析,经20s 的酶解,可从2μg 大肠杆菌提取蛋白 中鉴定出333 种蛋白质。 以聚乙烯乙二胺作为金属离子的固定化配体,研制了一种基于聚丙烯酰胺基质的金属 离子鳌合再生型IMER。与传统的金属离子再生型IMER 相比,可将再生步骤从2 步缩短 为1 步。将其用于大肠杆菌提取蛋白的分析酶解,经50s 的酶解,可从150ng 样品中提取 鉴定出78 种蛋白质。 提出一种相比与传统尿素辅助的胰蛋白酶酶解更为高效的蛋白质样品处理方法。该方 法特点在于将天冬氨酸位点切割与胰蛋白酶切割相结合。使用这种方法分析鼠肝蛋白质 组,鉴定出1,335 条肽段,对应295 种蛋白质;而使用传统尿素辅助方法处理,只鉴定出 1,107 条肽段,对应231 种蛋白质。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://cas-ir.dicp.ac.cn/handle/321008/116577
专题中国科学院大连化学物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
吴帅宾. 蛋白质组酶解的新技术和新方法研究[D]. 中国科学院研究生院,2012.
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